CARBUNCLO BOVINO: SU INFECCION AL HUMANO, DIAGNOSTICO POR METODOS TRADICIONALES Y CARACTERIZACION MOLECULAR (PCR).Noseda R. (1), Mock M. (2), Levy M. (2), Cordeviola J.M. (1), Fiscalini B. (1), Bigalli C. (1), Combessies G.M. (1), Martinez A.H. (1), Bardón J.C. (1), Acuña C.M. (3). (1) Laboratorio Azul Diagnóstico S.A. - 25 de Mayo 479. (7300) Azul, Buenos Aires, Argentina. E-mail: labazul@satlink.com.ar. Palabras Clave: Antrax, Bacillus anthracis, caracterización molecular, bovino, hombre. RESUMENSe describe un brote de Carbunclo Rural donde mueren 25 bovinos y padecen Carbunclo dérmico 2 personas. Los 304 bovinos que componían el rodeo habían sido vacunados con vacuna esporulada cepa Sterne 120 días previos a la ocurrencia del mismo. Posibles causas ambientales predisponentes extrínsecas e intrínsecas fueron evaluadas. Se aislaron e identificaron cepas de B. anthracis de origen: bovino, humano, vacunal y edáfico, aplicando métodos de la microbiologia tradicional y nuevos métodos de identificación por amplificiacion genética (PCR), lograndose coincidencia entre ellos. Se evaluó la sensibilidad antibiótica de las mismas. Se implementaron y evaluaron nuevas técnicas para la eliminación de cadáveres por la metodología del Tapado Controlado. RÉSUMÉCHARBON BOVIN: SON INFECTION A L'HUMAIN, DIAGNOSTIQUE PAR DES MÉTHODES TRADITIONNELLES ET DE CARACTÉRISATION MOLÉCULAIRE (PCR) Mots clef: Antrax, Bacillus anthracis, caractérisation, bovin, homme. On décrit une poussée de charbon rural où 25 bovins meurent et 2 personnes souffrent le charbon dermique. Les 304 bovins qui composaient le rodeo avaient été vaccinés avec un vaccin sporulé souche Sterne, 120 jours avant l' occasion de la même. Des causes possibles de l'environnement prédisposantes extrinsèques et intrinsèques ont été evaluées. On a isolé et identifié des souches de B. anthracis d' origine: bovine, humaine, vaccinale et du sol, en appliquant des méthodes d' identification de la microbiologie traditionnelle et de nouvelles d' identification par amplification génétique (PCR), en obtenant des coïncidences entre elles. On a évalué de nouvelles techniques pour l' élimination de carcasses par la méthodologie de l' Enterrement Contrôlé. INTRODUCCIONEl carbunclo en la Argentina es una enfermedad endémica, que afecta principalmente al ganado bovino y a las personas que viven en el campo, trabajando con ellos. En 1609 se describió una enfermedad con similares características epidémicas que atacó a bovinos y ovinos afectando también la salud de indios y pobladores; los síntomas y lesiones observados, presentan una notable similitud a los producidos por el carbunclo (actas del Cabildo de la ciudad de Buenos Aires)1. Los contínuos ataques epidémicos de la enfermedad carbunclosa fue factor de estímulo para que los Estancieros y el Estado Nacional, conformaran los inicios de los estudios universitarios de Veterinaria (1883) 1. , ambito este que posibilitó la incorporación de expertos de Francia para producir la vacuna anticarbunclosa en nuestro país (1887). Laboratorio Azul desde 1977 mantiene un registro de diagnóstico de la enfermedad que posibilitó conocer cual ha sido la distribución porcentual, anual y estacional, en 30 partidos de la Provincia de Buenos Aires4. En el período 1977-2000 sobre un total de 2.018 muestras se realizaron 279 (14%) aislamientos de Bacillus anthracis5. En igual período y en la misma área geográfica, 83 personas padecieron la enfermedad carbunclosa de las cuales 2 murieron. Con los antecedentes planteados, se decidió estudiar un brote de carbunclo bovino en un establecimiento ganadero de la Pcia. de Bs.As. donde dos personas padecieron carbunclo dérmico. El objetivo del presente trabajo fué: a)Evaluar y comparar los métodos tradicionales de diagnóstico bacteriológico con una técnica de diagnóstico molecular (PCR), hasta este momento no utilizada en nuestro país para esta bacteria. b)Caracterizar las cepas de Bacillus anthracis involucradas: bovinas, humanas, del suelo (edáficas) y vacunal. c)Evaluar un nuevo método de eliminación de cadáveres bovinos, denominado Tapado Controlado (tc). MATERIALES Y METODOSECOSISTEMA GANADEROEl brote de Carbunclo se desarrolló en el establecimiento agricola-ganadero El Perdido, ubicado en el partido de Olavarria, provincia de Buenos Aires, con una extensión de 2.139 hectáreas y una población de 1.600 bovinos de la raza Aberdeen Angus, conformada por las categorías de vacas, toros, terneros y vaquillonas, repartidos en distintos rodeos. El rodeo involucrado constituído por 304 animales de los cuales murieron 25 (8%), perteneciendo 20 (80%) a la categoría de adultos (toros, vacas y vaquillonas) y 5 (20%) juveniles (terneros y terneras). El manejo de los mismos se realizaba en 13 potreros subdivididos en 69 parcelas por alambrados eléctricos de acuerdo al sistema de Pastoreo Rotativo, lo que significaba una alta carga instantánea de animales por hectárea ganadera utilizada. El personal involucrado en el área ganadera estaba constituído por tres personas (1 Encargado y 2 Peones). El brote se inició el 8/3/99 y perduró hasta el 4/6/99, (88 días). El rodeo estaba vacunado con vacuna cepa Sterne con una dosis de 2 c.c. por animal, vía subcutánea, aplicada por personal del establecimiento 120 días previos a la aparición de la enfermedad. TAPADO CONTROLADOPara la esterilización de los cadáveres y de las zonas aledañas de suelo donde ocurrieron derrames de fluidos cadavéricos, se evaluó un metodo 10. adaptado de una experiencia realizada por la Universidad de California de EEUU, para la esterilización de suelo denominado tapado controlado (tc), consistente en: a)cubrir los cadáveres con óxido de calcio (cal de construcción). b)tapar con cubierta plástica (de 3m. X 3m.) tipo agropol color negro de 100 micrones de espesor. c)sujetar los bordes con tierra extraída del perímetro para crear un ambiente cerrado de microaerofilia y temperatura elevada, producto de la heliofanía del día y de la propia descomposición. Se procedió al tapado controlado de los 25 cadáveres y a los 140 (tc1) y 253 (tc2) dias post-tapado se procedió a la extracción de muestras de huesos largos de los restos cadavéricos y suelo de las zonas aledañas a los derrames sanguíneos de nariz-boca y ano-vagina, para evaluar la evolución del proceso de esterilización y cuantificar los esporos sobrevivientes de B. anthracis. TOMA DE MUESTRAS
DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICOAISLAMIENTO Y TIPIFICACION BACTERIANASe utilizó la misma metodología de diagnóstico para las muestras bovinas, humanas, vacunales y de suelo. La coloración de Gram para la identificación de morfologías bacterianas, el cultivo en Agar Sangre de Ovino al 5 % donde se observó las morfologías, hemólisis, plasticidad y consistencia de las colonias desarrolladas. En el caso de los suelos se realizó una inactivación térmica previa, a 65 Cº y luego su aislamiento en medio selectivo de Plet para su identificación y cuantificación ( Inst. Pasteur). La evaluación bioquímica sobre aislamientos morfológicamente compatibles permitió determinar: movilidad, catalasa, glucosa, indol, ureasa, citrato, nitritos 4. Una vez efectuada la confirmación preliminar, se utilizó la técnica API 50 CHB con identificación asistida por informática APILAB PLUS bioMerieux, como confirmación final2 ANTIBIOGRAMASe determinó la sensibilidad a los antibióticos de uso mas frecuente en medicina humana y veterinaria, utilizando la técnica de difusión con discos de papel de concentración media (Britania) aplicando la técnica de Kirby y Bauer de acuerdo a los procedimientos de referencia N.C.C.L.S . Los antibióticos evaluados fueron: Penicilina, Ampicilina, Gentamicina, Tetraciclina, Florfenicol, Ciprofloxacina, Trimetroprima-Sulfatometoxasol, Clindamicina, Cefalotina, Eritromicina, Aminopenicilina-Sulbactama, Rifampicina y Vancomicina. INOCULACION EN ANIMALES DE LABORATORIOPor cada cepa aislada se inocularon 2 ratones albinos (Charles RiverCF1) producidos en nuestro bioterio, con un peso promedio por animal de 17 gr.. El inóculo fue de 0,3 c.c. vía subcutánea, con una densidad aproximada de 3x10 5 esporas bacterias por c.c.; dejando un ratón sin inocular como testigo. Los animales se observaron cada 6 hs., evaluandose las manifestaciones clínicas hasta el momento de su muerte; se efectuó la necropsia extrayendo muestras del bazo para recuperación y tipificación del B. anthracis inoculado. AMPLIFICACION GENICA IN VITRO - PCRPara su carcterización molecular las cepas de Bacillus anthracis fueron derivadas al Instituto Pasteur de París, Francia (Unidad de Toxinas y Patógenos Bacterianos). El método usado consistió en amplificar de manera selectiva una secuencia conocida de ADN, delimitada por dos oligonucleótidos. Los fragmentos del gen, amplificados, fueron corridos en un gel de agarosa en 0,5 de buffer Tris-borato-EDTA durante cuatro horas a una potencia de 80 V, revelados con Bromuro de ethidiun y visualizados por transiluminación con luz ultravioleta. La genotipificación de las cepas se realizó mediante una múltiplex 6. PCR la cual permitió la detección de genes de virulencia: antígeno protector (pag), toxina edematógena (cya), factor letal (lef) pertenecientes al plásmido pX01 y una secuencia intergénica del plásmido pX02, necesaria para la síntesis de cápsula (Cap.B-C). Con igual metodología también se identificaron el marcador cromosómico Ba 813 y la Tanda Repetida de Número Variable V.N.T.R. RESULTADOSEVALUACION DEL ECOSISTEMA GANADEROEl 87% de las muertes de los animales ocurrió durante los meses de marzo y abril (verano/otoño). De los 11 (100%) potreros donde pastoreo el rodeo, en 8 (73%) ocurrieron muertes. En el potrero identificado con el nº11 sucedieron el 36% de las muertes y en el nº16 el 20%, en este último los animales hacia 72 hs. que habian ingresado, provenientes del potrero nº5 que limitaba con una parcela de un establecimiento vecino, donde en días anteriores habían ocurrido muertes de animales por carbunclo. AISLAMIENTO Y TIPIFICACION BACTERIANASe aislaron dos cepas bovinas (protocolos 76.369 y 76.482), una cepa humana (protocolo 18.517) y dos cepas edáficas (protocolo 76.482-1-2) resultando todas morfológica y bioquímicamente compatibles con B. anthracis, la identificación por Api 50 CHB demostró una coincidencia del 98.8% para este género bacteriano. La cepa vacunal Sterne (protocolo 91.679) si bien mostró morfología y bioquímica tradicional compatible, la técnica de Api 50 CHB evidenció solo el 2 % de compatibilidad con B. anthracis y del 96% con B.cereus, siendo la acidificación de la arbutina a las 24 hs. el resultado discrepante con las cepas bovinas y humanas. ANTIBIOGRAMA
INOCULACION EN ANIMALES DE LABORATORIOLas cepas bovinas (protocolos 76.369 y 76.482) y humanas (protocolo 18.517) demostraron igual patrón de patogenicidad matando los ratones inoculados a las 28 hs. En el punto de inoculación se observó edema gelatinoso sanguinolento y en cavidad abdominal hepato-esplenomegalia manifiesta, lográndose recuperar en pureza el B.anthracis inoculado. La cepa vacunal Sterne (protocolo 91.679) no mostró evidencias de patogenicidad, sacrificándose los animales a las 144 hs. de inoculados. En el punto de inoculación se observó leve edema, hígado y bazo no evidenciaron alteraciones, no logrando aislar flora bacteriana. AMPLIFICACION GENICA in vitro PCR
TAPADO CONTROLADOEn la evaluación de los tc (1y2), el tc1 a los 140 días poseía una vegetación aledaña de cardos y tréboles exuberantes comparado con el resto de la flora circundante, su interior mostraba una masa pastosa gris con gran cantidad de larvas de insectos y un fuerte olor fétido. La temperatura interior era de 38º C., en un día seminublado con 28º C. de temperatura ambiente. En el tc2 a los 253 días, la flora mostraba idénticas características de mayor exuberancia, la materia orgánica se había degradado quedando únicamente las partes óseas y restos de cuero, no se visualizaban larvas de insectos, ni olor fétido, registrándose una temperatura interior de 32º C. Los médulos cultivos realizados en el material cadavérico de ambos tc fueron negativos a la presencia de B.anthracis. El suelo de la zona de derrames sanguíneos boca-ollares y ano-vagina del tc2 fue cultivado evidenciando en ambas muestras la presencia de 200 y 300 esporas de B.anthracis por gramo de suelo evaluado (protocolo 76482-1-2). DISCUSIONLo ocurrido en este establecimiento ganadero es la síntesis de esta zoonosis. La historia lugareña identifica la zona como de ¨campos malditos¨ por sus reiterados antecedentes de carbunclo. Lo llamativo de los hechos es que sus animales habían sido inmunizados con vacuna cepa Sterne, 120 días previos al brote. Es necesario considerar las condiciones predisponentes que se presentaron al momento de ocurrir la enfermedad: a)arrastre de esporas de un campo vecino que estaba padeciendo la enfermedad 6 al potrero nº 5. b)la temporada verano-otoñal, predisponente, con una distribución estacional de aislamientos de B. anthracis en bovinos muertos súbitamente del 21% en verano y del 14% en otoño4, 5. c)pastoreo rotativo con alta carga instantánea de animales por hectárea ganadera que posibilitó que mayor número de animales consumieran a un mismo tiempo pasturas con una alta contaminación de esporas de B.anthracis. d)el cuereo de los animales muertos facilitando la diseminación junto a la pérdida de sangre incoagulada por las aberturas naturales6.Cada una de estas causas aportaron elementos que conjugados hicieron a la aparición y mantenimiento del brote por 120 días consecutivos, produciendo la muerte de 25 bovinos y la enfermedad a 2 personas. Esto revela una realidad de las costumbres en el trabajo rural, donde en el 43% de los establecimientos ganaderos realizan el desollado o cuereo de los animales que mueren súbitamente 6. , práctica que ayuda a activar el ciclo de la enfermedad favoreciendo el proceso de resistencia bacteriana (esporulación). Lo peligroso es la exposición del personal a un riesgo biológico extremo, al carecer de capacitación manipulan sin protección un material altamente infeccioso. El tapado controlado debería seguir siendo evaluado, ya que después de 253 días la materia orgánica se encontraba degradada en su totalidad y aún se encontraron 200 - 300 esporos de B.anthracis por gramo de suelo en la zona de derrames. El quemado final de la cobertura, la remoción de la capa superficial de tierra (arada) y el desarrollo de una cobertura vegetal, han permitido que dichos potreros fueran pastoreados por animales con doble vacunación anual (cepa Sterne), sin que se produjeran muertes por esta causa luego de 914 días de ocurrido el último deceso. Las técnicas de aislamiento e identificación tradicional han demostrado ser efectivas siempre que se cuente con personal entrenado, muchas de las mismas se basan en el reconocimiento de morfologías macro-microscópicas de los distintos componentes bacterianos. La técnica de API 50 CHB 2. fue eficiente con las cepas salvajes aisladas tanto en animales como personas, pero cuando se evalúa la cepa vacunal Sterne, su porcentaje de calificación decayó significativamente (solo 2%), para B. anthracis. La determinación de la sensibilidad antibiótica es necesario efectuar en cada aislamiento ya sea en muestras de animales como de humanos, pues de ocurrir la transmisión al hombre durante un brote, se dispondría de la información adecuada para comenzar el tratamiento. El hallazgo de cepas resistentes a la Penicilina y Ciprofloxaciona 6. refuerzan la necesidad de realizar su correspondiente antibiograma en cada aislamiento. La inoculación en animales de laboratorio (ratón blanco) en forma subcutánea, demostró ser un método eficiente, la muerte se produjo en promedio a las 28 hs. para las cepas bovinas y humanas, no causando mortandad la cepa vacunal Sterne. La amplificación génica in vitro PCR, concordó con los métodos de identificación tradicional, evidenciando una seguridad adicional apreciable. Es la primera vez que en la Argentina se aplica el diagnóstico por PCR en un brote de Carbunclo Rural que permitió verificar la relación animal-hombre, y caracterizar la cepa vacunal Sterne7, 9. Incorporar esta técnica que evalúe los componentes de los plásmidos de virulencia, marcador cromosómico y Tanda Repetida de Numero Variable es un desafío para compatibilizar con el diagnóstico tradicional hasta tener certezas y costos factibles de instrumentar en la rutina diagnóstica de países como la Argentina. CONCLUSIONESLos animales aunque inmunizados 120 días previos al brote con cepa Sterne, no pudieron soportar la alta exposición a la ingesta de esporas de B.anthracis, en un sistema productivo con alta carga instantánea de bovinos por hectárea. Los antecedentes de ¨campo maldito¨, la temporada verano-otoñal predisponente y el cuereo de los animales muertos, dieron el marco para la aparición de este brote epidémico. El diagnóstico certero por ambos métodos (tradicional y PCR) ofrece elementos necesarios para implementar medidas coherentes y evitar la difusión del Carbunclo en el sistema ganadero. Las técnicas de diagnóstico tradicionales demostraron ser efectivas resolviendo el mismo en 48-72hs. Las técnicas moleculares (PCR) demostraron su relación diagnóstica, siendo necesario evaluar su puesta a punto y costo de implementación para diagnósticos de rutina en nuestro país. Capacitar al personal rural sobre nociones básicas de la epidemiología de las zoonosis y la manera de evitar su contagio es una de las deudas que la sociedad tiene para con ellos. Desterrar el hábito de cuerear animales muertos súbitamente es la clave para evitar la transmisión de la enfermedad al hombre. Eliminar adecuadamente los animales muertos en el campo, es el desafío para una futura sanidad animal más eficiente. El Tapado Controlado y el quemado posterior de sus residuos pueden ser una solución de alternativa. BIBLIOGRAFIA
Publicado en la Revista Veterinaria Argentina Vol. XIX Nº188 Octubre 2002 Bs. As.- Argentina. |